Progetto PIVOLIO

Processi Innovativi per la Valorizzazione dell’OLIO extravergine di oliva

nelle province di Bari e Foggia


OR 1.  COLLEZIONAMENTO DELLE FOGLIE E DEI CAMPIONI DI TERRENO. ANALISI DEI CAMPIONI DI DNA E DEL TERRENO

R.I.  Attività di ricerca industriale 

Soggetti attuatori:

  • Azienda Oliveti Terra di Bari (OTB)
  • Azienda Olearia Basile di Andria
  • CRA di Rende (CS)
  • Consorzio CARSO, Valenzano

 

La O.P. “OLIVETI TERRA DI BARI“  dopo aver avviato il Progetto PON01_01958 Titolo “Processi innovativi per la valorizzazione dell’olio extravergine di oliva nelle province di Bari e Foggia ( PIVOLIO )” ha concretizzato con le diverse attività svolte i risultati attesi attraverso i diversi obiettivi realizzativi di ricerca industriale.

Il progetto ha avuto come scopo lo sviluppo di processi innovativi atti a qualificare la filiera dell’olio extravergine di oliva mediante la caratterizzazione e la valorizzazione degli oli monovarietali nelle province di Bari e Foggia.

L’obiettivo progettuale è stato quello di collegare le caratteristiche organolettiche e nutraceutiche dell’olio extravergine monovarietale con quelle genetiche della cultivar di appartenenza e la comparazione delle analisi standard  con quelle spettroscopiche di risonanza magnetica nucleare ( RMN )

1.1 Individuazione degli alberi di olivo nelle aree geografiche interessate 

Gli operatori delle Aziende “Oliveti Terra di Bari” e “Olearia Basile” hanno provveduto alla individuazione dei terreni dove allocavano le quattro cultivar del progetto: Coratina, Cima di Mola, Ogliarola (in provincia di Bari) e Peranzana (in provincia di Foggia). 

In ogni appezzamento di terreno relativo alle diverse aziende afferenti alle cooperative è stato individuato un albero di olivo che rappresenta la cultivar dell’appezzamento individuato. 

In questa fase di avvio l’Unita Operativa di Ricerca della Organizzazione dei Produttori Oliveti di Terra di Bari  ( OTB ) si è impegnata nella definizione territoriale delle aree oggetto della ricerca industriale.

I dirigenti e consulenti hanno collaborato alla individuazione e definizione delle aree partecipando ai numerosi incontri realizzati presso le sedi delle cooperative olivicole associate e presso alcune sedi di associazioni di categorie per esporre ai produttori olivicoli le finalità operative del Progetto PON01_ 01958 “ PIVOLIO”.

In questi incontri sono state individuate le disponibilità delle aziende a partecipare al Progetto e successivamente sono stati stimati i diversi appezzamenti su cui individuare gli alberi da campionare, in merito all’area geografica di appartenenza e in relazione alla cultivar olivicola da prendere in considerazione ai fini del progetto.

Questa fase operativa è stata svolta nei mesi di novembre e dicembre 2012 ed il tutto è stato realizzato impegnando il personale dipendente delle cooperative associate che hanno operativamente dato vita al coinvolgimento e sensibilizzazione delle aziende olivicole coinvolte.

Dopo aver individuato le aziende si è proceduto ad effettuare visite e sopralluoghi aziendali per individuare gli appezzamenti idonei e gli alberi da campionare ai fini del Progetto compilando per ogni azienda la scheda di adesione al Progetto.

Avendo comunque individuato le aziende e gli appezzamenti idonei, si è deciso in questa fase di coinvolgere in prima istanza aziende strettamente legate alle cultivar considerate dal progetto: Coratina, Ogliarola, Cima di Mola e Peranzana.

Nella successiva fase di  raccolta delle olive dall’appezzamento in cui ricadeva l’albero campionato, è stato curato il trasporto, lo stoccaggio e la molitura partitaria con lo scopo di effettuare un iniziale prelievo campione di olio rappresentativo dell’azienda e della cultivar oggetto di ricerca, da inviare ai partners scientifici coinvolti nel progetto di Ricerca.

Per quanto riguarda la Cultivar Ogliarola questa attività è partita a metà dicembre 2012, in concomitanza con le fasi di raccolta delle olive dalle cultivar ed è proseguita con le altre cultivar.

Al fine di raccogliere un adeguato numero di campioni rappresentativi delle aziende e delle aree di nostro interesse, sono state individuate le modalità con cui gli operatori di ricerca coinvolti nel progetto dovessero affiancare le aziende in tutte le fasi di raccolta e trasformazione delle olive.

Dall’appezzamento in cui è presente l’albero campione sono state raccolte le olive che sono state trasportate al frantoio.

Della stessa partita di olive è stato controllato il periodo di stoccaggio fino alla molitura per poter infine prelevare un campione di olio.

Dopo la raccolta di un campione di olio rappresentativo dell’azienda, si è proceduto ad identificare lo stesso con un codice provvisorio, in attesa della formulazione di un codice alfanumerico definitivo concordato con gli altri partner del progetto. Questo campione è stato partizionato in sub-campioni e inviato ai partner coinvolti nel progetto per le analisi, secondo un protocollo di intesa. Difatti ciascun campione ottenuto è stato preliminarmente sottoposto a decantazione per la separazione della fase organica dell’olio dalla fase acquosa ancora presente; successivamente per migliorare il processo di separazione, i campioni sono stati sottoposti a filtrazione tramite garze e successivamente imbottigliati e sigillati. 

Con questa procedura sono stati raccolti n. 240 campioni di olio rappresentativi della Cultivar Coratina, n. 60 campioni di olio rappresentativi della Cultivar Ogliarola Barese, n. 90 campioni di olio rappresentativi della Cultivar Cima di Mola e 60 campioni della cultivar Peranzana.

A tutte le aziende è stato assegnato un codice identificativo che in seguito è diventato il codice dell’albero redigendo un elenco dove sono riportati tutti i dati anagrafici aziendali.

Per i campioni di olio rappresentativi sono stati individuati e redatti  i relativi codici di campionamento che sono stati correttamente apposti sulle bottigliette in vetro scuro seguendo una procedura di campionamento ed etichettatura dello stesso campione. Tutte le bottiglie da 250 ml  correttamente raggruppate per cultivar e imballate in appositi contenitori sono state trasportate presso il Consorzio C.A.R.S.O., che ha provveduto a distribuirle ai vari partner. Prima della consegna ogni campione di olio è stato filtrato e frazionato in più campioni.

Questa attività di individuazione delle aree, degli appezzamenti e degli alberi campione si è protratta per il periodo compreso tra Gennaio e Febbraio  2013 periodo in cui sono stati effettuati tutti i sopralluoghi aziendali per verificare la corrispondenza delle caratteristiche dell’appezzamento con i criteri determinati.

In collaborazione con i tecnici delle cooperative, si è predisposta una scheda aziendale che, corredata da appositi documenti, fornisse l’anagrafica e la localizzazione catastale dell’azienda, i dettagli tecnici e agronomici dell’appezzamento coinvolto nel progetto e le operazioni colturali effettuate nell’ultimo periodo di riferimento. Le schede sono necessarie per futuri progetti che saranno svolti in collaborazione con le aziende.

Questa parte del programma è stata realizzata dagli operatori di ricerca delle due aziende che hanno coinvolto e illustrato ai proprietari degli appezzamenti le modalità per la raccolta delle olive e delle foglie che sono state utilizzate per l’analisi genetica della pianta.

Le olive sono state trasportate in frantoi dove sono stati allocati i micromolitori (per un totale di 5 apparecchiature) che sono stati utilizzati per la molitura delle olive e la produzione dei campioni di olio per ogni albero codificato.

In futuro, anche dopo il completamento del progetto, l’olio prodotto da ogni azienda con codice anagrafico, di cui un campione è stato studiato, potrà essere sottoposto ad analisi nutraceutica ed ulteriori indagini per una certificazione differenziata.

L’analisi ha consentito di identificare e codificare una macroarea per ciascuna cultivar. All’interno di ciascuna macroarea sono state selezionate le aree geografiche omogenee per specificità territoriale e pedologiche  in modo che le possibili varianti pedoclimatiche potessero individuare le diverse cultivar.

 

Per la cultivar Coratina sono state selezionate e catalogate 8 aree geografiche:

A001: comuni di Andria, Barletta, Canosa, Trinitapoli e parte del comune di Minervino;

A002: comune di Minervino;

A003: comuni di Bisceglie, Corato, Trani;

A004: comune di Ruvo di Puglia;

A005: comuni di Bitonto, Giovinazzo, Palombaia, Santo Spirito, Bitonto;

A006: comuni di Palo del Colle, Sannicandro di Bari, Bitetto, Binetto, Grumo Appula, Bitonto Mariotto, Bitonto Palombara, Palo del Colle;

A007: comune di Terlizzi;

A008: comuni di Acquaviva delle Fonti, Cassano Murge, Sano Michele di Bari, Gioia del Colle.

 

Per la cultivar Ogliarola sono state selezionate e catalogate 2 aree geografiche:

A009: comune di Molfetta;

A010: comune di Giovinazzo, Bitonto Terlizzi, Bitetto.

 

Per la cultivar Cima di Mola sono state selezionate e catalogate le 3 aree geografiche:

A011: comuni di Polignano, Conversano, Castellana parte del comune di Monopoli;

A012: comuni di Monopoli, Castellana;

A013: comuni di Alberobello, Turi, Castellana, Putignano, Noci.

 

Per la cultivar Peranzana sono state selezionate e catalogate 2  aree geografiche: 

A014: comuni di San Paolo Civitate,Torremaggiore, Serracapriola ( FG ) .

A015: comuni di Foggia, Sansevero, Lucera ( FG ) .

 

1.2 Attribuzione del codice alfanumerico

Ogni albero è stato numerato e codificato per un totale di 450 alberi. È stato creato un codice alfanumerico in collaborazione con l’azienda Apuliabiotech.

Il codice identificativo dell’albero campione è stato creato assemblando le seguenti parti:

  • A001 - sequenza alfanumerica identificativa dell’area geografica interessata;
  • 01 - numero progressivo da 1 a 30 della singola area;
  • 110001 - codice Istat Agro Comunale;
  • OTB - anagramma azienda di riferimento;
  • 000001 - numero progressivo generale a sei cifre riferito a tutti i campioni.

la sequenziale combinazione di questi elementi ha determinato la creazione del codice alfanumerico adottato per la codifica dei nostri campioni.

 

1.3 Installazione di sensori di umidità e temperatura

Nel settembre 2013 sono state installate n. 10 centraline per la rilevazione dei dati metereologici (temperatura e umidità) in alcune macroaree. La distribuzione delle centraline sul territorio è stata effettuata in funzione del livello alfanumerico della macroarea interessata e della maggior presenza e distribuzione degli alberi campionati.

Le centraline sono state collocate nei seguenti territori:

Nel periodo di settembre 2013 sono state installate e messe in ricezione n° 10 centraline per la rilevazione dei dati meteorologici (temperatura e umidità di alcune macroaree) nella provincia di BARI e BAT; nel mese di gennaio 2014 sono state installate nell’area della cultivar peranzana altre n. 2 centraline di rilevazione. 

 

La distribuzione delle centraline sul territorio interessato alla ricerca è stata effettuata in funzione del livello altimetrico della macroarea interessata e della maggiore presenza e distribuzione degli alberi campionati nell’area.

Per queste motivazioni, a partire dalle aree a Nord di Bari, la prima centralina è stata collocata nell’area che comprende gli agri comunali di Andria, Barletta, Canosa e Trinitapoli.

La seconda centralina è stata collocata nell’area murgiana ed esattamente nel territorio che comprende gli agri limitrofi del comune di Minervino Murge.

La terza centralina è stata collocata, muovendo in direzione sud seguendo la dorsale murgiana e premurgiana, nel territorio compreso tra gli agri comunali di Ruvo di Puglia, Corato e Terlizzi.

La quarta centralina è stata installata lungo la fascia costiera compresa tra gli agri comunali di Molfetta, Bisceglie e Giovinazzo.

La quinta centralina è stata posizionata nel territorio riconosciuto con il nome di Conca Barese comprensivo degli agri comunali di Bitonto, Palo del Colle, Bitetto e Palombaio.

La sesta  centralina è stata posta nella zona compresa tra gli agri comunali di Acquaviva delle Fonti, Cassano e Grumo Appula.

La settima centralina è stata installata tra gli agri comunali di Casamassima,  Turi e Conversano.

Proseguendo sempre verso Sud, è stata installata lungo la fascia premurgiana Tarantina una ottava centralina negli agri comunali di Castellana Grotte, Putignano e Alberobello.

Muovendosi verso la parte interna  di questa fascia, è stata collocata la nona centralina nell’area di Gioia del Colle.

Infine è stata collocata la decima centralina nel territorio costiero della cosiddetta piana di Monopoli.

  

ANALISI DATI DELLE CENTRALINE

Riportando le coordinate geostazionarie delle centraline è stato possibile elaborare una mappa delle stesse con GoogleMaps e così è stato possibile avere una panoramica complessiva sul posizionamento. Tramite un software online del produttore delle centraline è stato possibile consultare in tempo reale il corretto funzionamento delle stesse e quali fossero i valori dell’ultima rilevazione effettuata dalle centraline.

Queste ultime erano configurate affinché eseguissero in maniera del tutto automatizzata più rilevazioni dei parametri (temperatura, umidità e mm di pioggia) durante il corso della giornata, per un numero complessivo di rilevazioni variabile tra 25 e 50, con la registrazione dell’orario relativo di analisi.

Ad intervalli temporali costanti ( circa due volte al mese ) si è provveduto a scaricare offline i dati memorizzati nelle centraline e a formattarli all’interno di un file excel per le elaborazioni necessarie. Si sono calcolate le medie giornaliere per i valori di temperatura e umidità e i valori cumulativi giornalieri per i mm di pioggia; di conseguenza è stato possibile calcolare anche le medie settimanali e mensili.

 

1.4 Raccolta foglie e meristemi

Il   prelievo delle foglie dagli alberi  campionati è stato effettuato  seguendo il protocollo di campionamento del  CRA Oli di Rende.

La raccolta dei  rami giovani delle cultivar individuate è servita per l’estrazione del  DNA e lo studio genetico delle piante.

L’intervento è stato realizzato staccando le foglie in buono stato di vegetazione ad altezza d’uomo  e dal punto di vista operativo, per la rilevazione e la selezione del patrimonio genetico delle quattro cultivar ( Coratina, Ogliarola, Cima di Mola e Peranzana)  è stata applicata la seguente procedura di raccolta del materiale biologico:

 

Protocollo di   campionamento  delle foglie  di  olivo  per  analisi  molecolari

Materiale occorrente:

-guanti di lattice

-mascherina antipolvere ( utilizzata per evitare l’inalazione della silica quando le foglie sono state raccolte ed immerse nel gel di silica )

- buste  di plastica, sacchetti di plastica normali, purchè  robusti

- nastro  adesivo

- buste o  bustine  di carta

- graffettatrice

- pennarello  e  penna

- silica  gel

- forbice

- carta  tipo scottex

- contenitore  ( dove deporre  la  busta  di plastica contenente la silica  gel e  i campioni)

- blocco  notes per  annotare  l’elenco dei campioni

 

Modalità  di prelievo: 

1)    Sono stati versati nella  busta  di plastica circa 500 g  di  silica gel ( è sufficiente per un  prelievo di 50-60 campioni. La busta è stata contrassegnata con i codici dell’area campionata    (luogo, appezzamento, data del prelievo). 

2)    E’ stato assegnato il   codice  della  pianta.

3)    Sono state scelte 5-10  foglie  giovani  e sane ( a  seconda della lunghezza:  se  erano  lunghe almeno 3-4cm ,ne bastavano 5 , se molto piccole, sono state raccolte  a 10-15  foglioline).

4)    Sono stati indossati  i guanti  per spezzettare le foglioline  con  la forbice o  con le  mani in pezzetti  della  dimensione massima di 0,5 cm x 0.5  cm.

5)    Tra  un campionamento e l’altro sono stati puliti i guanti o le forbici  con lo scottex  e dopo aver prelevato  5-6 campioni sono stati  cambiati i guanti.

6)    I  pezzettini  di foglia sono stati conservati in bustine di carta e  sigillate  con la graffettatrice

7)    I sacchetti  sono stati posti verticalmente nella  busta contenente la silica gel

8)    Ogni busta di plastica è stata chiusa con il nastro adesivo e deposta nel contenitore.  Ogni scatola è stata contrassegnare con il codice dell’area di prelievo/appezzamento ed inserita la data del campionamento.

9)    Ad ogni contenitore è stato allegato  un elenco dei  campioni  con i  rispettivi codici  e informazioni  sull’area di campionamento, con la relativa data di prelievo.

10)  I contenitori sono stati inviati al centro di Ricerca per l’olivicoltura e l’Industria Olearia di Rende ( CS ) per l’analisi genetica.

 

1.5 Raccolta dei campioni di terreno intorno all’albero di olive

Per la raccolta dei campioni di terreno è stato adottato il seguente protocollo di prelevamento, manipolazione e  conservazione del campione:  

 

Modalità prelievo campioni di suolo 

Contestualmente al prelievo del materiale vegetale sono sono  prelevati tre campioni di terreno, sul limite esterno della proiezione della chioma. I punti di prelievo sono stati  individuati dai vertici di un ideale triangolo equilatero. I tre campioni sono stati miscelati a formare un solo campione per pianta. Per ogni punto di prelievo è stato  eliminato lo strato superficiale per circa 5 cm di profondità e si è proceduto al prelievo lungo il profilo da 5 cm fino a 30-35 cm(a seconda della presenza della roccia madre). Nello specifico si è realizzato il prelievo mediante zappa o vanga in modo da poter recuperare anche le pietre e il materiale grossolano per la determinazione dello scheletro.

 

 PREPARAZIONE  DEL  CAMPIONE  PER  LE  ANALISI  E DETERMINAZIONE  DELLO  SCHELETRO

 (Metodo ufficiale di analisi chimica del suolo)

  1. Tutto il campione è stato steso su una superficie piana, pulita e asciutta del laboratorio; dopo accurata omogeneizzazione, sono state separate da più punti, casualmente, diverse aliquote rappresentative che, riunite, hanno costituito il campione grezzo per l’analisi.
  2. Il campione grezzo per analisi è stato trasferito su vassoio di carta o plastica in uno strato di÷2cm di spessore ed essiccato all’aria, in ambiente protetto, a temperatura ambiente;
  3. Il campione è stato pesato a temperatura ambiente.
  4. Sono stati conservati circa 400 g di terra fine in contenitori puliti, asciutti, chiusi ermeticamente e chiaramente identificati con il codice alfanumerico.
  5. Il materiale rimasto sul setaccio ha costituito lo scheletro che è stato successivamente  lavato con un getto d’acqua, per eliminare le particelle di terra fine eventualmente aderenti, per poi  essiccarlo e pesarlo. 

La quantità di scheletro è stata  espressa in g / Kg-1 senza cifre decimali si ricava dalla relazione:

Scheletro  ( g/kg ) =  m1 /m2 × 1000                              

m1  =   massa dello scheletro ( in g )   -    m2  =  massa del campione grezzo per analisi ( in g )

Ogni campione è stato posto in sacchetti sigillati e consegnato al  Consorzio C.A.R.S.O., Capofila del Progetto Pivolio. La consegna del materiale è stata sempre registrata con un verbale.

Per questo tipo di attività sono stati impegnati direttamente gli operatori di ricerca  delle cooperative che per tutto il mese di  novembre  hanno raggiunto gli appezzamenti individuati, hanno prelevato i campioni e li hanno caratterizzati con l’assegnazione del codice alfanumerico specifico per il terreno; hanno provveduto allo stoccaggio nei contenitori a loro assegnati, recapitando gli stessi presso le cooperative di riferimento e procedendo con tutte le operazioni descritte sino all’ottenimento dei campioni da sottoporre ad analisi.

Per L’esecuzione di questa attività è stata utilizzata una strumentazione idonea al fine di effettuare il setacciamento della terra fine. Sono stati utilizzati n. 7 setacci con certificato di conformità serie ASTM (diam. 500 mm; altezza Standard; rete in acciaio Inox luce netta mm:2).  

 

1.6 Estrazione del DNA dalle foglie

E’ stata effettuata l’estrazione del DNA genomico dai 450 campioni fogliari utilizzando il kit di estrazione commerciale SIGMA-ALDRICH. L’attività è stata condotta in collaborazione con il Dipartimento di Scienze del suolo, della pianta e degli alimenti (Di.S.S.P.A.),Università degli Studi di Bari ,“Aldo Moro”(referente Dr.ssa Cinzia Montemurro). Il DNA estratto è stato quantificato e valutato per la sua qualità ( rapporti 260/280 e 260/230) utilizzando lo spettrofotometro Nanodrop 2000.Il DNA è stato diluito a 5-10 ng/ul per la conduzione delle amplificazioni PCR.

L’estrazione del DNA genomico è stata ripetuta per una serie di 17 campioni  per due scopi: è stato  effettuato un ring test per valutare la riproducibilità delle analisi condotte presso il CRA-OLI e l’UNI BA. Inoltre per alcuni campioni il risultato della analisi molecolari ha mostrato che si trattava di entità non riconducibili geneticamente alla 4 varietà di riferimento e pertanto sono state ripetute le analisi ricampionando le accessioni.

Parallelamente è stato messo a punto un protocollo di preparazione del tessuto grezzo al fine di testare la nuova Taq polimerasi KAPA3G. I campioni fogliari sono stati sminuzzati  dentro a buste di carta, mantenuti in silica gel per 2 giorni. Sono stati prelevati 5mg di tessuto fogliare disidratato e polverizzati mediante Tissue lyzer (QIAGEN). Al campione è stata aggiunta un’aliquota di 50ml di acqua sterile.

 

1.7 Conservazione dei campioni di DNA

I campioni di DNA sono stati conservati a -80°C mentre le piastre di DNA genomico diluito per le reazioni PCR sono state conservate a -20°C. I campioni polverizzati sono stati conservati a - 20°C.

 

1.8 Analisi dei campioni mediante PCR

E’ stato messo a punto un protocollo di identificazione genetica in multiplex che prevede con l’impiego di DNA l’amplificazione di 7  loci SSR contemporaneamente.

Le amplificazioni PCR sono state condotte in multiplex con  combinazioni di 1-3 primer per ciascun fluoro foro scelto utilizzando sia DNA sia tessuto grezzo disidratato come precedentemente descritto.

I 450 campioni di DNA genomico diluiti sono stati amplificati in reazione PCR con un numero variabile di loci SSR (da 4 a 7) con lo scopo di ottimizzare il protocollo di amplificazione. E’ stata selezionata la Taq Polimerasi migliore per la reazione in Multiplex (Taq Polymerase recombinant, INVITROGEN) , la quantità ideale di DNA e la concentrazione ottimale dei primer. E’ stato ottenuto un protocollo efficiente per l’analisi molecolare con 5 loci SSR amplificati in multiplex ( DCA3, DCA5, DCA8, DCA18, GAPU71b).  L’analisi molecolare è stata condotta su circa la metà dei campioni dal Dipartimento di Scienze del suolo, della pianta e degli alimenti (Di.S.S.P.A.),Università degli Studi di Bari ,“Aldo Moro”( referente Dr.ssa Cinzia Montemurro) utilizzando un set di 6 ssr ( DCA3.DCA9, DCA15, DCA18,  GAPU71b, GAPU101) per valutare la riproducibilità del metodo messo a punto dal CRA-OLI. 

Parallelamente è stata testata l’efficacia della Taq Polimerasi KAPA 3G (Resnova) nell’amplificazione in multiplex direttamente da tessuto crudo. Sono state effettuate diverse amplificazioni PCR per l’ottimizzazione del protocollo, partendo da foglie disidratate e polverizzate e da tessuto fresco. I migliori risultati sono stati ottenuti utilizzando foglie polverizzate e ottimizzando la concentrazione dei primer in un range da 70 a 350 nM. E’ stato organizzato un protocollo di amplificazione con 7 ssr.

 

1.9 Analisi dei dati

Il CRA-OLI ha realizzato le amplificazioni PCR che sono state analizzate con un sequenziatore a 16 capillari (3130 Applied Biosystems).  Il dato ottenuto è stato elaborato con  software GeneMapper 3.7v. Lo studio dei dati effettuato su 450 campioni, ha condotto all’ottenimento di 443 profili molecolari omogenei, corrispondenti alle rispettive varietà di riferimento. I 450 campioni di DNA hanno mostrato quasi tutti  corrispondenza genetica  con le  quattro cultivar di riferimento Coratina,  Ogliarola barese ( o Cima di Bitonto), Peranzana e Cima di Mola.

I risultati del ring test hanno mostrato che la metodologia adottata è uniforme e che consente di fornire risultati univoci. Mentre la ripetizione delle analisi molecolari delle accessioni anomale ha confermato la diversità genetica rispetto alla varietà di riferimento per i seguenti campioni :

CIMA DI MOLA 

Campione 305 : entità genetica diversa da Cima di Mola corrispondente a SIMONA

Campione 323: possibile variante clonale (alleli diversi del DCA18 e DCA9)

Campione 328: entità genetica diversa  da Cima di Mola, corrispondente a Cima di Melfi

Campione 361: entità genetica diversa da Cima di Mola e molto vicina a Pasola

Campione 382: entità genetica diversa da Cima di Mola corrispondente a SIMONA

Campione 385: entità genetica diversa da Cima di Mola e non corrispondente ad alcuna varietà analizzata

Campione 386: possibile variante allelica ( alleli diversi del DCA3 e  DCA9).

Riassumendo, sono state identificate 4 entità genetiche differenti riconducibili a varietà pugliesi (Simona, Pasola, Cima di Melfi) ed altre che si considerano varianti clonali.

 

1.10 Immissione dei dati nel database

In riferimento all’immissione dei dati nel sistema informatico presente sul portale web www.pivolio.it gli operatori di ricerca della Oliveti Terra di Bari, hanno impegnato nelle varie fasi un monte ore di circa 500 ore, durante le quali hanno immesso i dati relativi alle analisi NIR effettuate durante le campagne olivicole, unitamente ai dati anagrafici aziendali dei produttori olivicoli coinvolti nel progetto.

 

1.11 Analisi dei campioni di terreno prelevati al limite estremo del fogliame

I risultati delle analisi dei terreni delle 15 aree sono riportati nelle tabelle dell’allegato 1.

 

1.12 Analisi di carbonio organico, azoto totale, carbonati totali

Sono state completate le determinazioni di: carbonio organico, azoto totale, carbonati totali, calcare attivo, pH (in H2O e in KCl) e conducibilità elettrica di tutte le 15 aree del progetto.

 

1.13 Analisi del fosforo assimilabile

Sono state completate tutte le analisi chimiche relative a fosforo assimilabile, cationi scambiabili (K, Ca, Mg, Na), rapporto C/N, metalli pesanti, di tutte le 15 aree del progetto.

 

1.14 Analisi dei micronutrienti

Sono state completate tutte le analisi chimiche relative a (Zn, Fe, Mn, Cu) di tutte le 15 aree del progetto.

 

1.15 Immissione dei dati nel database

Attività di sviluppo precompetitivo

Sviluppo di un protocollo efficiente per l’identificazione genetica

E’ stata sviluppata una metodologia di analisi per l’identificazione genetica che prevede un protocollo standardizzato per il campionamento fogliare e l’analisi di identificazione genetica con 7 ssr.

Il protocollo è di seguito descritto:

Campionamento fogliare: raccolta di 2-3 foglioline giovani e sane in una bustina di carta.

Conservazione del campione sminuzzato in piccoli pezzi per 3 giorni in silica gel.

Polverizzazione di 5 mg di foglia e risospensione in 100 ul di acqua sterile.

Prelievo di 1ml di aliquota.

Amplificazione con KAPA 3G utilizzando i seguenti micro satelliti: DCA3,DCA5, DCA8, DCA18, DCA9, GAPU71b, DCA1. Il protocollo di amplificazione  e il profilo termico utilizzati sono descritti in tabella 1 e 2.

Analisi del dato mediante sequenziatore a 16 capillari e software GeneMapper 3.7v.

Il protocollo è stato validato utilizzando 126 cultivar di varia provenienza geografica con 7 loci SSR amplificati in multiplex; esso ha dimostrato un’efficienza discriminate del 92% ed una capacità discriminante a livello intervarietale del 100%. (Figura 1).  Il protocollo è stato testato su alcuni campioni di Coratina del progetto per valutarne la riproducibilità. Il set di primer selezionato è il seguente : DCA3, DCA5, DCA8, DCA9, DCA14,DCA18 e GAPU71b (Figura 2). 

 

Sviluppo di un protocollo di valutazione dei micronutrienti nel terreno

Sono stati sviluppati e adattati i protocolli di analisi nei suoli di:

carbonio organico, azoto totale, carbonati totali, fosforo disponibile, cationi scambiabili, metalli pesanti, micronutrienti (Zn, Fe, Mn, Cu). Le analisi sono state determinate secondo i protocolli delle metodiche ufficiali di analisi chimica del suolo pubblicate sulla Gazz. Uff. Suppl. Ordin. n° 248 del 21/10/1999.

 

S.P. Attività di sviluppo precompetitivo

È stato realizzato il protocollo per l’analisi genetica delle piante di olivo 

Il protocollo per la valutazione dei micronutrienti

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