Progetto PIVOLIO

Processi Innovativi per la Valorizzazione dell’OLIO extravergine di oliva

nelle province di Bari e Foggia


OR 2.  RACCOLTA DELLE OLIVE, PRODUZIONE DI OLIO IN LABORATORIO ED ACQUISIZIONE DEGLI SPETTRI NMR 

Soggetti attuatori:

  • Azienda Oliveti Terra di Bari (OTB)
  • Azienda Olearia Basile di Andria
  • Consorzio CARSO, Valenzano
  • Laboratorio di Chimica Generale ed Inorganica (Di.S.Te.BA) dell’Università di Lecce

 

2.1 Raccolta delle olive dall’albero contrassegnato con codice identificativo

Gli operatori tecnologici delle ditte olearie (Oliveti Terra di Bari e Basile di Andria) hanno provveduto alla raccolta delle olive degli alberi identificati e contrassegnati con codice identificativo durante le campagne olearie 2013/14 e 2014/15 .

In questa fase  sono state portate a conclusione tutte le operazioni di raccolta e micromolitura delle olive  prelevate dagli alberi campionati.

L’intervento è iniziato con le cultivar che avevano un livello di invaiatura e maturazione maggiore, che spesso variava a seconda delle condizioni di coltivazione degli appezzamenti (asciutto o irriguo). Pertanto le unità operative di ricerca hanno effettuato ulteriori sopralluoghi per constatare il livello di maturazione delle drupe e poi procedere alla raccolta.

Quindi, a seconda delle aree geografiche selezionate e partendo dalla Cultivar Ogliarola, che ha una naturale precocità di maturazione rispetto alle altre, dai primi giorni di dicembre 2013 sono state attivate le operazioni di raccolta.

Gli operatori di ricerca, organizzati in gruppi di lavoro, dopo aver  raggiunto l’albero contrassegnato, hanno avviato la fase di raccolta delle olive mediante l’utilizzo di reti raccoglitrici adagiate sotto la chioma dell’albero, effettuando la brucatura delle drupe anche con l’utilizzo di agevolatori manuali.

Le olive raccolte sono state raggruppate al centro della rete e ripulite dal materiale vegetativo grossolano caduto durante l’operazione di brucatura. Dopo questa operazione, a seconda della dotazione naturale dell’albero, sono state prelevate circa 25-30 kg di olive per ogni albero e rigorosamente apposte in cassette areate contrassegnate dal codice identificativo dell’albero. 

Dopo la raccolta delle olive, le stesse sono state trasportate presso le unità di trasformazione Olearia ( Coop. Socie dell’OTB / Olearia Basile ) dove sono stati allocati i micromolitori per procedere entro le 48 ore all’operazione di micromolitura ed estrazione del campione di olio.

La stessa operazione è stata realizzata durante la campagna olivicola 2014/15.

 

2.2 Produzione in laboratorio dei campioni di olio extravergine con uso del micromolitore

Le olive raccolte sono state distribuite in cassette specifiche e numerate, anch’esse con il codice identificativo dell’albero di provenienza e trasportate presso il frantoio prestabilito dove erano presenti i micromolitori.

Il protocollo di micromolitura utilizzato nel progetto è consistito in un processo di estrazione a freddo dell’olio attraverso tre fasi di lavorazione successive: la molitura delle olive mediante un frangitore a coltelli, la gramolazione della pasta di olive e una separazione fisica attraverso centrifuga orizzontale a due fasi.

La strumentazione utilizzata è stata lo Spremiolive C30 della Toscana Enologica Mori, che ha una capacità massima di carico 30Kg di olive per lavorazione. Questa modalità tecnica è stata molto utile ai fini progettuali, perché era prevista una lavorazione per ciascun campione di olive raccolto e la strumentazione era adeguata ed ottimizzata alla capacità produttiva media delle piante. Inoltre la compattezza della strumentazione ha permesso una sua semplice installazione nelle stanze dedicate all’interno delle cooperative socie, con relativo allaccio all’impianto idrico ed elettrico.

 

Con il noleggio di cinque Spremiolive C30 è stato possibile ridurre i tempi di lavorazione dei campioni, in modo da garantire l’esecuzione della stessa entro le 48h dalla raccolta. I tecnici di ciascuna cooperativa coinvolti nelle attività del progetto, già addestrati, hanno curato il confezionamento e l’identificazione mediante etichettatura dell’olio prodotto.

Nel corso della campagna olivicola 2013/2014 i tecnici hanno condotto le operazioni preliminari di messa in funzione e taratura dello strumento Spremiolive C30 con il tecnico incaricato dalla ditta produttrice. I campioni di olive anche della stessa cultivar hanno, però, presentato una variabilità molto elevata nelle caratteristiche dimensionali della drupa: i tecnici hanno lavorato olive di siccita, per le quali era necessario l’apporto di un ulteriore quantitativo di acqua direttamente nella pasta di olive, e olive irrigate le quali presentavano un elevato grado di idratazione. In questa fase è stata riscontrata la difficoltà nel valutare e prevedere un adeguato apporto di acqua tramite il flussimetro corredato allo strumento che garantisse un’efficiente separazione delle due fasi all’interno della centrifuga. Tale valutazione non è stata rigorosamente programmata, ma eseguita secondo una stima visiva della pasta all’interno della gramola prima che venisse trasferita all’interno della centrifuga. Inoltre dovevano essere calibrati per ogni campione i livelli di pescaggio delle valvole all’interno della centrifuga orizzontale. Pertanto per alcuni campioni è stata riscontrata la presenza di residui di acqua nel prodotto in uscita, che ha richiesto un ulteriore processo di filtrazione su garza. Tale operazione non è comunque risultata esaustiva per alcuni campioni. Invece, nella campagna olivicola 2014/2015 le olive hanno presentato una minore variabilità dimensionale il che ha permesso di standardizzare maggiormente le procedure di trasformazione, anche grazie all’esperienza acquisita in fase di lavorazione dagli operatori impiegati sulle macchine. Inoltre è stato previsto un ulteriore processo di decantazione all’interno di imbuti separatori appositamente dedicati, che permettesse di perfezionare la separazione della fase solida residuale dalla fase oleosa e dalla fase acquosa che costituivano il sottoprodotto di lavorazione.

Per poter effettuare le operazioni di micromolitura è stato necessario  istruire, addestrare e rendere manualmente pronti gli operatori di ricerca alle procedure da adottare.

Quindi nelle fasi preliminari, al fine di testare l’attrezzatura, sono state realizzate prove di micromolitura, utilizzando quantità di olive presenti nelle Coop. Olearie, con la presenza del personale tecnico della ditta che ha noleggiato l’attrezzatura.

Questi interventi preliminari hanno permesso di tarare le macchine e quindi di dare il via alle operazioni di micromolitura dei campioni di olio provenienti dagli alberi campionati e debitamente contrassegnati con il proprio codice campione.

Per ogni singola operazione di micromolitura è stato impiegato un tempo medio di circa tre ore a campione con esclusione dei tempi di lavaggio macchina per il passaggio da un campione all’altro.

Le olive sono state prima ripulite da eventuale presenza di materiale vegetativo come foglie e rametti, dopo sono state immesse gradualmente nella piccola tramoggia di carico alla cui base è posta una coclea elicoidale che trasporta  le olive nel frangitore meccanico.

Dal frangitore meccanico le olive frante sono passate nella gramola dove sono state amalgamate da mescolatori circolari per circa 40 minuti, e successivamente spinti da una pompa pasta nel piccolo Decanter ( Centrifuga Orizzontale) per l’estrazione dell’olio.

Il campione di olio raccolto alla base del micromolitore, dopo una grossolana e  leggera operazione di filtrazione, è stato distribuito direttamente in lattine dalla capienza massima di tre litri.

Il campione di olio proveniente da ciascun albero è stato codificato e contrassegnato per essere successivamente sottoposto ad una prima caratterizzazione con l’ausilio di un analizzatore NIR.

La stessa operazione è stata effettuata per la campagna olivicola 2014/15.

Il Consorzio C.A.R.S.O. ha collaborato con le aziende agricole al filtraggio dell’olio e alla suddivisione di ogni campione in 4/6 bottiglie scure da 200 mL con tappo a vite. Tali bottiglie sono state conservate in ambiente privo di luce e a temperatura ambiente, per evitare il deterioramento dell’olio.

 

2.3 Analisi NIR dei campioni di olio extravergine di oliva monovarietale

Oliveti Terra di Bari, in qualità di partner partecipante al progetto P.O.N. Pivolio, si è occupata di svolgere le analisi chimico-fisiche utilizzando la tecnolgia N.I.R. (Near Infra Red) sui seguenti parametri:

Acidità             0.39          % ac.oleico     

Perossidi            8.30          meqO2/kg      

K232                    2.06         

K270                   0.056       

DeltaK                0.002       

AcPalmitico       15.19        %        

AcPalmitoleico      1.37     %        

AcEptadecanoico 0.11     %        

AcEptadecenoico 0.10     %        

AcStearico             1.93          %        

AcOleico                67.53        %        

AcLinoleico           12.49        %        

AcLinolenico         0.73          %        

AcArachico            0.36          %        

AcEicosenoico     0.30     %        

PolifenoliTOT       248.26      ppm    

TocoferoliTOT     169.16 ppm    

EsteriMetilici       9.32          ppm    

EsteriEtilici         1.50          ppm    

EsteriMetilEtilici  17.59   ppm

Per l’esecuzione di questa attività è stata utilizzato uno spettrofotometro NIR modello XDS Rapid Liquid Analyser della FOSS caratterizzato dai seguenti componenti:

  • monocromatore n° 3010-1681
  • modulo liquidi matr. n° 3015-0857
  • standard matr n° WST3W513
  • sistema comprendente computer HP fisso, monitor 19”, stampante HP Deskjet, software proprietario ISIscan Full Licence.

L'XDS Rapid Liquid Analyser di FOSS è una strumentazione basata sulla tecnologia ad infrarossi per eseguire analisi quantitative e qualitative su liquidi e sospensioni. Lo strumento XDS utilizza lo spettro vicino all’infrarosso (area dello spettro definita dalla lunghezza d'onda compresa tra i 700 nm ed i 2500 nm).

La zona vicino all’infrarosso è l'area ideale dello spettro per eseguire misurazioni di prodotti naturali finalizzate a valutare le caratteristiche chimiche di liquidi, solidi, sciroppi o campioni gassosi.

Tutti i prodotti basati sulla tecnologia NIR si avvalgono di un monocromatore a reticolo dispersivo, che ha il più alto rapporto segnale/rumore. Questa proprietà della tecnica permette una maggior precisione e capacità di analizzare le matrici ad alta dispersione e multifase.

L’analisi N.I.R. è stata effettuata utilizzando campioni di olio extravergine di oliva provenienti dalla singole moliture opportunamente realizzate nelle sedi delle cooperative socie e raccolti in contenitori di latta per alimenti di 3L.

Successivamente i campioni sono stati tutti aliquotati in vials di vetro scuro della portata di 10 mL e conservati lontano da fonti di calore e luce.

I campioni da analizzare non hanno necessitato di una fase preparatoria, pertanto sono stati direttamente sottoposti ad analisi utilizzando lo strumento N.I.R. XDS Foss, dotato di un sistema di lettura ad infrarossi, che ha previsto l’uso di cuvette in quarzo da 1,5 mL.

Metodologia utilizzata

Per la procedura si è scelto di processare ogni campione per tre volte in modo da osservare le oscillazioni nei risultati dovute alla lettura dello strumento.

Tutti i campioni sono stati ripartiti per aree geografiche ed i relativi report raccolti in altrettante cartelle. Ogni report è costituito da tre parti: il riferimento al progetto PIVOLIO,  il riferimento anagrafico (azienda produttrice del campione, committente e riferimenti temporali),  i venti parametri chimico-fisici analizzati e i relativi “valori di riferimento”, in modo da evidenziare subito una alterazione del campione.

 

2.4 Acquisizione e processamento dei campioni mediante analisi RMN ed intercalibrazione (strumenti Bruker 500 e 400 MHz) 

Due aliquote di 2 mL sono state preparate per ciascuno campione d’olio di oliva in tubi di vetro scuro e distribuite alle due piattaforme di metabolomica (Consorzio C.A.R.S.O. e Di.S.Te.BA) sia per la campagna olearia 2013/2014 sia per quella 2014/2015.

L’analisi RMN è stata effettuata mediante il prelievo di pochi microlitri di olio direttamente dalla bottiglia, diluiti in 600 μL di cloroformio deuterato, in modo da rispettare il rapporto di 13.5 % olio/86.5 % CDCl3, w/w (Bruker, Italia). Il campione è stato in seguito inserito in un apposito tubicino del diametro di 5 mm lungo circa 20 cm. Per ogni campione è stato effettuato un esperimento standard 1D (1H NMR), che mette in evidenza i segnali della componente maggioritaria degli oli. Sono stati effettuati, inoltre, esperimenti 1H NMR con specifici programmi di impulsi finalizzati all’enhancement della componente minoritaria rispetto alla componente maggioritaria (Bruker Biospin).

 

2.5 Acquisizione degli spettri di RMN 

L'analisi completa dei 450 campioni per ciascuna delle due annate, per un totale di 900 campioni, è stata effettuata presso l'unità di ricerca del Di.S.Te.B.A. Il Consorzio C.A.R.S.O. ha effettuato l’analisi metabolomica su un subset di campioni d’olio di oliva mediante lo spettrometro Bruker Avance DRX 500 MHz. Per la campagna olearia 2013/2014, il Consorzio ha acquisito gli spettri RMN protonici di 80 campioni selezionati casualmente (20 campioni per cultivar). L’acquisizione RMN del pattern metabolico è stata ripetuta sui campioni di olio provenienti dallo stesso subset di piante per la campagna 2014/2015.

In ciascun laboratorio (Università del Salento e Consorzio C.A.R.S.O.) sono stati effettuati per ogni campione di olio spettri monodimensionali 1H RMN, rispettando le medesime condizioni sperimentali per acquisizione e processamento. Un singolo esperimento, di breve esecuzione (la durata per ciascuno è di alcuni minuti), è in grado di fornire un numero elevato di informazioni riguardo alla composizione chimica del campione. Il Confronto dei pattern di RMN è stato effettuato mediante l’utilizzo di tecniche di analisi statistica multivariata (MVA).

 

2.6 Analisi degli spettri con metodi statistici

Per ogni spettro RMN è stato effettuata una operazione che scompone lo spettro in aree o istogrammi di ampiezza di base opportuna (buckets). Per questa operazione sono stati utilizzati appositi software (Software Analysis of Mixtures, Amix vers. 3.9.13, Bruker Biospin), dedicati allo studio metabolomico di miscele. Gli spettri (nella finestra spettrale considerata da 10.00 a 0.5 ppm) sono stati segmentati in rettangoli di base fissa di 0.04 ppm, ottenendo i buckets (con metodo di generazione dei buckets con segmentazione in rettangoli di base fissa, “normal rectangular bucketing”). Cruciale in questa operazione è stata la scelta dell’ampiezza di base di tali istogrammi, poiché un singolo bucket deve possibilmente comprendere selettivamente l’area di un intero segnale RMN; è anche possibile, a seconda dei casi, unire uno o più buckets oppure selezionare un’ampiezza maggiore. Gli spettri RMN ottenuti sono stati processati e digitalizzati per eseguire le analisi di statistica multivariata.

In particolare, il Corsorzio C.A.R.S.O., in collaborazione con il Di.S.Te.BA, si è proposto di dimostrare la robustezza della metabolomica basata sulla RMN nella classificazione della cultivar degli oli d’oliva. A tale scopo, mediante l’analisi statistica PLS-DA (Partial Least Squares - Discriminant Analysis), sono stati analizzati e confrontati i dati spettrali ottenuti sullo stesso set di campioni (n = 80), preparati e testati indipendentemente nei due laboratori di Valenzano e di Lecce, da due operatori diversi e usando spettrometri a differente risoluzione (Bruker 500 e 400 MHz, rispettivamente). Sono stati valutati i possibili effetti sulla performance dei modelli statistici dovuti sia all’uso di differenti metodi di pre-processamento dei dati spettrali sia alle differenze di operatore e di strumento. La comparazione tra i dati RMN ottenuti dai due laboratori ha rivelato differenze nella linea di base degli spettri, nell’intensità e nell’ampiezza dei picchi. Ciononostante, la quantità di informazioni condivisa dai due dataset (in termini statistici) è risultata significativamente elevata (circa 70%) e correlata alla cultivar. Entrambi i dataset hanno individuato gli stessi metaboliti discriminanti, principalmente acidi grassi saturi e mono-insaturi. Tale attività è documentata dalla recente pubblicazione: Piccinonna S, Ragone R, Stocchero M, Del Coco L, De Pascali SA, Schena FP, Fanizzi FP. Robustness of NMR-based metabolomics to generate comparable data sets for olive oil cultivar classification. An inter-laboratory study on Apulian olive oils. Food Chemistry 199, 15:675-683 (2015).

 

2.7 Individuazione degli oli monovarietali mediante le reti neurali artificiali

Il Corsorzio C.A.R.S.O., in collaborazione con il Politecnico di Bari, si è anche proposto il duplice obiettivo di (1) individuare il sottoinsieme di variabili più rilevante ai fini della classificazione dei campioni di olio extravergine di oliva e (2) utilizzare le Reti Neurali Artificiali (Artificial Neural Networks, ANN) come strumento di classificazione del tipo di cultivar di provenienza dei campioni di olio di oliva (fra coratina, ogliarola barese, cima di mola e peranzana).

 

2.8 Immissione dei dati nel database

Dopo la fase preliminare di elaborazione degli spettri in matrice di dati, è stata condotta un'analisi esplorativa sui dati prodotti, ovvero un’ analisi di carattere generale mediante la quale è stato possibile estrarre informazioni relative alla struttura dei dati. Il database risultante da questa operazione preliminare allo studio chemiometrico dei dati spettrali consiste di una matrice formata da 221 buckets (in colonna) e 920 campioni (in riga). I 920 campioni di olio sono costituiti dai 450 campioni/anno più un set di 20 campioni utilizzati come test set esterno ottenuto da oli di produzione industriale, utilizzando le cultivar oggetto di studio. Le suddette matrici di dati RMN sono state analizzate mediante analisi statistica multivariata (MVA). È stata eseguita l’analisi multivariata esplorativa (ossia l’analisi delle componenti principali, PCA) e le analisi di classificazione PLS-DA, OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis), con lo scopo di evidenziare eventuali differenze e/o attinenze tra i campioni stessi.

 

SP. Attività di sviluppo precompetitivo

  1. Realizzazione di prototipo: protocollo per l’acquisizione spettroscopica tramite RMN dell’olio extravergine di oliva monovarietale.

 

La realizzazione del protocollo per la preparazione di ciascun campione di olio per l’analisi RMN è stata effettuata mediante il prelievo di pochi microlitri di olio direttamente dalla bottiglia, diluiti in 600 μL di cloroformio deuterato, in modo da rispettare il rapporto di 13,5 % olio/86,5 % CDCl3, w/w (Bruker, Italia). Il campione è stato in seguito inserito in un apposito tubicino del diametro di 5 mm lungo circa 20 cm. Per ogni campione è stato effettuato un esperimento standard 1D (1H NMR), che ha messo in evidenza i segnali della componente maggioritaria degli oli. Sono stati effettuati, inoltre, esperimenti 1H NMR con specifici programmi di impulsi finalizzati all’enhancement della componente minoritaria rispetto alla componente maggioritaria (Bruker Biospin).

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