Progetto PIVOLIO

Processi Innovativi per la Valorizzazione dell’OLIO extravergine di oliva

nelle province di Bari e Foggia


OR 5.  NUTRACEUTICA E POTERE ANTI-OSSIDANTE ED ANTI-INFIAMMATORIO DEGLI OLI EXTRAVERGINI DI OLIVA MONOVARIETALI 

R.I.  Attività di ricerca industriale

Soggetti attuatori:

  • Laboratorio di Biochimica del Di.S.Te.BA dell’Università di Lecce
  • Istituto di Fisiologia Clinica del CNR (Lecce)
  • Clinica Medica dell’Università di Bari
  • Consorzio CARSO, Valenzano (BA) 

 

Il Consorzio CARSO ha fornito agli altri soggetti attuatori quattro campioni rappresentativi, uno per ciascuna cultivar (convenzionalmente chiamati blend). Ogni blend è stato ottenuto unendo uguali quantità di campioni appartenenti alla stessa cultivar, della campagna olearia 2013/2014, risultati extravergini al panel test.

 

5.1 Studio in vitro degli estratti di oli extraverigini di oliva monovarietali su culture di epatociti primari e stabilizzati 

Il Laboratorio di Biochimica del Di.S.Te.BA dell’Università di Lecce ha effettuato gli studi in vitro degli oli extravergini di oliva. I modelli cellulari presi in considerazione sono stati selezionati tenendo in considerazione i tessuti in cui le vie biosintetiche di acidi grassi e colesterolo sono particolarmente attive.

Sono stati condotti esperimenti in vitro su colture primarie di epatociti di ratto ottenute attraverso perfusione epatica in situ. È stata testata l’attività dei singoli polifenoli e degli estratti (0,5-4 ore di incubazione) sulla vitalità cellulare attraverso MTT test, e sui processi di sintesi di acidi grassi, colesterolo e trigliceridi mediante saggi radioenzimatici. Successivamente sono stati studiati gli effetti dei singoli polifenoli e degli estratti (0,5-4 ore di incubazione) sui principali enzimi coinvolti nelle differenti vie di sintesi dei lipidi (colesterolo, acidi grassi e trigliceridi). Attraverso l’analisi spettrofotometrica sono state valutate le attività enzimatiche, mentre le analisi con PCR e Western blotting  hanno consentito di quantificare i livelli di mRNA e proteici degli enzimi selezionati.

Cellule HepG2 in coltura sono state utilizzate per valutare l’attività degli estratti (24 ore di incubazione) sulla vitalità cellulare attraverso MTT test, e sull’accumulo di trigliceridi attraverso saggi colorimetrici. Successivamente sono stati studiati gli effetti degli estratti  sui principali enzimi coinvolti nella lipogenesi, utilizzando metodi spettrofotometrici per l’analisi delle attività enzimatiche e saggi western blotting per la quantificazione dei livelli proteici.

Cellule C6 in coltura sono state utilizzate per valutare l’attività dei singoli polifenoli (4 e 24 ore di incubazione) sulla vitalità cellulare attraverso MTT test. Successivamente sono stati studiati gli effetti dei polifenoli sui principali enzimi coinvolti nella lipogenesi, utilizzando metodi radioenzimatici per l’analisi delle attività enzimatiche e saggi western blotting per la quantificazione dei livelli proteici.

 

5.2 Studio in vitro degli estratti di oli su culture primarie di endotelio vascolare umano ottenuto dalla vena di cordone ombelicale 

L'Unità operativa del Consiglio Nazionale delle Ricerche-Istituto di Fisiologia Clinica (CNR-IFC) di Lecce, come da progetto, si è occupata dello studio in vitro su colture primarie di endotelio vascolare umano delle proprietà anti-infiammatorie degli estratti polifenolici di oli extravergini di oliva.

Nella sezione di Lecce del CNR-IFC è stato da tempo messo a punto e caratterizzato un modello di infiammazione ed aterosclerosi costituito da cellule endoteliali umane isolate da vena di cordone ombelicale HUVEC (Human Umbilical Vascular Endothelial  Cells). Tale sistema è stato utilizzato per individuare nuove proprietà anti-infiammatorie della componente polifenolica dell’olio extra-vergine di oliva nota essere una componente  importante sia per le proprietà antiossidanti che per le proprietà anti-infiammatorie. (Scoditti E., et al. Arch Biochem Biophys. 2012; 527(2):81-9; Carluccio MA et al. Mol Nutr Food Res. 2007 Oct;51(10):1225-34.Review; Carluccio MA et al. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2007; 293(4):H2344-54; Carluccio MA et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2003, 23(4):622-9).

Nel presente progetto, utilizzando tale sistema di studio, è stata analizzata l’azione anti-infiammatoria dei diversi estratti fenolici ottenuti da blend di oli di oliva monovarietali (Cima di Mola, Coratina, Ogliarola e Peranzana) e di singoli polifenoli appartenenti alle seguenti classi polifenoliche (acido fenolico, alcoli fenolici, secoiridoidi, flavoni), valutando l’effetto sull’espressione endoteliale di molecole di adesione come le immunoglobuline VCAM-1 (Vascular Cell Adhesion Molecule-1) e ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1) e le selectine come E-selectina e di chemoattrattanti come MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein) in cellule endoteliali umane in coltura, in presenza di stimoli infiammatori.

I risultati ottenuti con gli estratti polifenolici hanno confermato quelli ottenuti  con i polifenoli puri (acidi fenolici, alcoli fenolici, secoiridoidi, flavoni).

Il CNR-IFC di Lecce ha raggiunto tutti gli obiettivi realizzativi indicati nel capitolato tecnico ottenendo risultati di ricerca innovativi che sono stati oggetto di pubblicazione su riviste internazionali.

E’ stato mostrata l’efficacia anti-infiammatoria di polifenoli appartenenti a diverse classi (Calabriso et al. Eur J Nutr. 2015 Feb 28)

Sono state individuate nuove proprietà anti-infiammatorie dell’idrossitirosolo, polifenolo tipico dell’olio di oliva, avendo mostrato che è in grado di ridurre l’infiammazione associata all’obesità. L’idrossitirosolo in concerto con l’acido oleico migliora la funzione metabolica e cardiovascolare, stimolando l'espressione di adiponectina, proteina secreta dagli adipociti con proprietà antidiabetiche, anti-aterogeniche ed anti-infiammatorie (Scoditti et al. PLoS One. 2015 Jun 1;10(6):e0128218).

E’ stata inoltre dimostrata l’efficacia degli estratti polifenolici dell’olio extravergine di oliva nel contrastare l’angiogenesi infiammatoria, processo patogenetico chiave nello sviluppo di malattie cronico-degenerative come il cancro e l'aterosclerosi. L’analisi del meccanismo di azione ha evidenziato un effetto degli estratti polifenolici nel ridurre lo stress ossidativo vascolare inibendo la NADPH ossidasi, principale enzima coinvolto nella produzione di specie reattive dell’ossigeno nelle cellule endoteliali (Calabriso et al. The Journal of Nutritional Biochemistry Volume 28, February 2016.)

In conclusione, i risultati ottenuti valorizzano gli oli di oliva extravergini pugliesi ricchi in polifenoli come nutraceutici con proprietà anti-infiammatorie in grado di contrastare i meccanismi che sono alla base delle patologie cronico-degenerative come l’aterosclerosi, l’obesità ed il cancro e contribuiscono a spiegare la funzione salutistica fornita dal loro consumo nell'ambito della dieta mediterranea tradizionale.

 

Elenco delle pubblicazioni prodotte: 

  1. Calabriso N, Scoditti E, Massaro M, Pellegrino M, Storelli C, Ingrosso I, Giovinazzo G, Carluccio MA. Multiple anti-inflammatory and anti-atherosclerotic properties of red wine polyphenolic extracts: differential role of hydroxycinnamic acids, flavonols and stilbenes on endothelial inflammatory gene expression. Eur J Nutr. 2015 Feb 28. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25724173.
  2. Scoditti E, Massaro M, Carluccio MA, Pellegrino M, Wabitsch M, Calabriso N, Storelli C, De Caterina R. Additive regulation of adiponectin expression by the mediterranean diet olive oil components oleic Acid and hydroxytyrosol in human adipocytes. PLoS One. 2015 Jun 1;10(6):e0128218. doi: 10.1371/journal.pone.0128218. eCollection 2015. PubMed PMID: 26030149; PubMed Central PMCID: PMC4452359.
  3. Calabriso N, Massaro M, , Scoditti E, D’Amore S, Gnoni A, Pellegrino M, Storelli C, De Caterina R, Palasciano G, Carluccio MA.  Extra virgin olive oil rich in polyphenols modulates VEGF-induced angiogenic responses by preventing NADPH oxidase activity and expression. The Journal of Nutritional Biochemistry Volume 28, February 2016, Pages 19–29 doi:10.1016/j.jnutbio.2015.09.026.

 

5.3 Studio in vivo delle quattro varietà (Coratina, Ogliarola Barese, Cima di Mola, Peranzana) di olio extravergine di oliva monovarietale su modello animale di infiammazione intestinale

Nell’ambito del Progetto Pivolio, l’Unità  UNIBA  si è occupata dell’attività di Ricerca su modelli animali di infiammazione intestinale.

Personale che ha partecipato all’attività progettuale: Prof. Gaetano Villani, Prof. Antonio

Moschetta, Dott. Vincenzo Rossiello, Dott.ssa Annalisa Contursi, Dott.ssa Roberta Le Donne, Sig. Michele Minuto.

Induzione chimica di infiammazione intestinale in un modello murino. Ci siamo avvalsi dell’uso del Destrano Sodio Solfato (DSS), un agente chimico in grado di indurre colite in modelli murini.

Utilizzo dell’olio come potenziale alimento nutraceutico. Gli animali sono stati randomizzati in base al loro peso corporeo e suddivisi in diversi gruppi denominati con i nomi delle cultivar di riferimento  più un gruppo controllo: Ogliarola, Cima di Mola, Coratina, Peranzana e Placebo, quest’ultimo costituito da soluzione fisiologica di Cloruro di Sodio allo 0,9%. Al fine di ridurre al minimo gli effetti da variabilità biologica, si è deciso di utilizzare 10 animali per gruppo.

Analisi giornaliera dei sintomi dell’infiammazione. Nel corso del protocollo, ogni giorno sono state registrate le variazioni di peso, l’arrossamento anale, sanguinamento rettale visibile e diarrea. Le variazioni di peso sono state analizzate al fine di valutare queste variazioni durante i vari giorni del trattamento. Inoltre sono state raccolte le feci al giorno 0, 3, 5 ,7 e 9 per  effettuare un test che rivela la presenza di sangue occulto nelle feci. Il Test HEMOCULT (Beckman Coulter) è un test immunochimico che stabilisce la presenza  di sangue occulto in campioni di feci mediante una risposta colorimetrica basata sull’emoglobino-positività.  Le test card Hemoccult contengono una carta da filtro impregnata di resina di guaiaco sulla quale si striscia il  campione di feci. Come sviluppatore della reazione del campione secco è stata utilizzata una soluzione alcolica di  perossido di idrogeno. In presenza di sangue occulto, il filtro di carta ha sviluppato una colorazione blu  entro 60 secondi. 

Raccolta degli organi e analisi. Il giorno 9, ultimo giorno di protocollo, gli animali sono stati sacrificati secondo i protocolli etici. I parametri valutati, che potevano cambiare in seguito  all’infiammazione, sono stati la lunghezza (in cm) e il  peso del colon (in mg). Durante il sacrificio sono stati prelevati colon, ileo, fegato e sangue. Dal sangue è stato estratto il siero e parte dei tessuti prelevati sono stai conservati a -80°C fino al momento dell’estrazione dell’RNA, oppure in formalina per 24 ore, poi passati in tampone fosfato e successivamente inclusi in  paraffina per le successive analisi istologiche. Il processo di inclusione in paraffina consente una conservazione duratura dei campioni. Successivamente mediante l’utilizzo del microtomo per ciascun campione sono state ottenute diverse sezioni utili per le successive colorazioni. In particolare è stata utilizzata un colorazione di base nello studio microscopico dei tessuti animali  quale l’ematossilina eosina. L’analisi istologica che consentirà di attribuire uno score relativo al grado di infiammazione intestinale dei  diversi gruppi in esame è attualmente in fase di completamento

L’RNA è stato estratto e purificato con il kit RNEasy (Qiagen). E’ stata valutata l’espressione genica di Interleuchina 1 β (Il-1β), Tumor Necrosis Factor α (TNF-α), Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOs), Tumor Growth Factor α and β (Tgf-α Tgf-β), Ciclossigenasi 2 (Cox-2), Interleuchine 6, 10 e 12 (Il-6, Il-10, Il-12) nel colon di tutti gli animali appartenenti ai diversi gruppi. Sul siero è stato effettuato un test chiamato Multiplex ELISA per lo studio delle principali citochine infiammatorie circolanti. Ci siamo avvalsi di una tecnica innovativa effettuata dalla ditta Bioclarma che utilizza il kit xMAP serum assay for cytokines distribuito dalla Biorad.

Analisi stastistica dei risultati. Tutti i risultati sono stati espressi come media±Errore Standard Medio (SEM) o Deviazione Standard (SD). L’analisi è stata condotta effetuando il test t di Student o l'analisi della varianza con il post Bonferroni Test hoc a seconda dei casi. Tutti i calcoli statistici sono stati eseguiti con Graph Pad software. I valori di p<0.05 sono stati considerati significativi.

 

5.4 Analisi dei dati e validazione dei modelli

Sintomatologia dell’infiammazione. I dati relativi al peso giornaliero registrato per ogni singolo animale appartenente ai diversi gruppi sono stati analizzati. Il nostro read-out è stato il decremento percentuale giornaliero rispetto al peso iniziale. Nei gruppi trattati con i diversi oli è infatti possibile osservare una riduzione percentuale del peso iniziale inferiore rispetto alla perdita di peso degli animali appartenenti al gruppo trattato con il placebo, indice dell’effetto protettivo che l’olio di oliva esercita in questo modello di infiammazione intestinale. In particolare, al giorno 9 è stata osservata una riduzione di peso pari al 24% nel gruppo trattato con il placebo rispetto al 18% nel gruppo che comprendeva tutti gli animali trattati con le diverse cultivar di olio. Se si analizzano in dettaglio le diverse cultivar è possibile osservare una protezione maggiore dalla perdita di peso con la cultivar Cima di Mola, e riduzioni paragonabili tra di loro per le restanti cultivar (Coratina, Peranzana e Ogliarola).

Allo stesso modo è stata valutata la presenza di sangue occulto nelle feci. Ci siamo basati sull’attribuzione di uno score che permette di stabilire il grado di severità della presenza di sangue occulto nelle feci nel corso del trattamento.  E’stato attribuito un punteggio compreso tra 0 e 4, indicando con 0 nessuna presenza di sangue occulto nelle feci e con 4 forte presenza di sangue occulto nelle feci. Dall’analisi dei dati è stato possibile affermare che la somministrazione di olio di oliva durante il protocollo di DSS mostrava un effetto protettivo, portando quindi a una riduzione dello score relativo alla presenza di sangue occulto nelle feci. In linea con in dati relativi alla perdita di peso, si è constatato che la cultivar Cima di Mola è quella che mostra un maggior effetto protettivo a livello della presenza di sangue occulto nelle feci, mentre la Peranzana è quella che non produce effetti rilevanti di protezione anti-infiammatoria.

 

Espressione di citochine circolanti nel siero. La Multiplex ELISA ha evidenziato che i livelli  sierici di citochine sia pro- (IL-1β, IL-2, IL-5) che anti-infiammatorie (IL-10 e IL-13) risultavano essere più elevati nei gruppi che assumevano giornalmente olio extravergine di oliva. In dettaglio i livelli più alti sono stati riscontrati nei topi trattati con gli olii provenienti dalle cultivar Ogliarola, Cima di Mola e Coratina. I gruppi Peranzana e Placebo mostravano allo stesso tempo un'espressione degli stessi marcatori paragonabile tra di loro senza alcuna differenza significativa. L’aumento dei livelli sierici di queste citochine è un evidente segno della risposta anti-infiammatoria dell'olio di oliva, che predispone alla risoluzione dei danni indotti dal DSS.

 

Espressione genica dei geni legati allo stato di infiammazione. A livello locale nel colon, è stata analizzata l’espressione genica delle principali interleuchine infiammatorie (per es. IL1-β, IL-6, TNFα). I topi trattati con olio di oliva delle cultivar Ogliarola, Coratina e Cima di Mola mostravano un’espressione ridotta di queste citochine, mentre l’olio di oliva Peranzana, non mostrava invece nessun effetto rilevante rispetto al Placebo. Questi risultati indicano che gli olii da cultivar Ogliarola, Coratina e Cima di Mola, una volta a diretto contatto con la mucosa intestinale, esercitano sulla stessa un’azione protettiva antinfiammatoria. Inoltre i dati relativi alla cultivar Peranzana, sono in linea con quanto osservato macroscopicamente valutando la riduzione del peso corporeo e la presenza di sangue occulto nelle feci.

In conclusione, questi risultati suggeriscono che le cultivar di olio di oliva Ogliarola, Cima di Mola e Coratina esplicano un'azione protettiva multilivello. A livello sistemico essi stimolano l'attivazione della macchina infiammatoria necessaria alla risoluzione dello stimolo dannoso dovuto all'utilizzo del DSS; mentre a livello della mucosa del colon le diverse cultivar esercitano una diretta azione antinfiammatoria, a protezione dai danni chimici provocati localmente dal DSS. Le citochine pro- e anti-infiammatorie hanno andamenti temporali ciclici e ben definiti, ma, nonostante i dati mostrino solo un'istantanea della risposta infiammatoria al momento del sacrificio, è interessante notare come l'effetto protettivo dell'olio di oliva a livello molecolare sia associato alla minore perdita di peso e minore presenza di sangue occulto nelle feci. 

 

SP. Attività di sviluppo precompetitivo

Realizzazione di piattaforme prototipali di modelli cellulari in vitro per studiare l’attività metabolica, anti-ossidante ed anti-infiammatoria degli estratti degli oli di oliva monovarietali

L’analisi quantitativa e qualitativa dei polifenoli caratterizzanti i differenti oli extra vergine di oliva pugliesi e lo studio dell’effetto dei singoli polifenoli dell’olio d’oliva e dell’estratto fenolico sulla lipogenesi epatica in colture primarie hanno lo scopo principale di portare alla realizzazione di piattaforme prototipali di modelli cellulari in vitro per studiare l’attività metabolica, anti-ossidante ed anti-infiammatoria degli estratti di oli di oliva monovarietali.

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